緊接前作《刺客教條:兄弟會》,現代刺客戴斯蒙·邁爾斯(Desmond Miles)與同伴露西·斯蒂爾曼(Lucy Stillman)、肖恩‧海斯汀(Shuan Hastings)及麗貝卡‧克琳(Rebecca Crane)已在朱諾神殿尋得「第一文明」(First Civilization)古代遺物「伊甸碎片」(Piece of Eden),而戴斯蒙於刺死露西後陷入昏迷狀態並被送返基因記憶追溯機器「Animus 2.0」以免精神崩潰。於安全模式「黑房」(Black Room)中,戴斯蒙遇上第十六實驗體之意識,獲告悉必須進入其兩名刺客祖先阿泰爾·伊本·拉哈德(Altaïr ibn La -Ahad)(詳看前作《刺客教條》)以及艾吉歐·奧迪托雷(Ezio Auditore da Firenze)仍未讀取的記憶,使Animus 2.0能把三人的記憶分開,重組其意識從而甦醒。